Het transiënte genexpressiesysteem is een van de meest vitale toegepaste wetenschappen voor het uitvoeren van doelgerichte eiwitevaluatie binnen het baculovirus in vitro celtraditiesysteem. Deze methode is ontwikkeld voor specifieke overzeese genen onder het beheer van de baculovirale promotor in tijdelijke expressieplasmiden. Bovendien zal deze techniek worden gebruikt voor een doelgerichte analyse van zowel het baculovirus zelf als overzeese eiwitten.
In wezen is het meest algemeen en commercieel beschikbare transiënte genexpressiesysteem voornamelijk ontwikkeld op basis van de onmiddellijk-vroege gen (IE) promotor van Orgyia pseudotsugata multicapside nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) . Niettemin werd een lage mate van expressie van overzeese genen in insectencellen opgemerkt. Vervolgens werd een tijdelijk genexpressiesysteem geconstrueerd voor het verbeteren van eiwitexpressie.
Op dit systeem waren recombinante plasmiden geconstrueerd om de doelsequentie op te nemen onder het beheer van de Drosophila warmteschok 70 (Dhsp70) -promotor. Dit protocol presenteert de toepassing van dit op warmteschok gebaseerde pDHsp/V5-His (V5 epitoop met 6 histidine)/Spodoptera frugiperda cel (sf9 cel) systeem ; deze techniek wordt niet alleen aangeboden voor genexpressie, maar ook voor het evalueren van de anti-apoptotische activiteit van kandidaat-eiwitten in insectencellen.
Bovendien zal deze techniek zowel worden getransfecteerd met één recombinant plasmide als gecotransfecteerd met twee ongetwijfeld functioneel antagonistische recombinante plasmiden in insectencellen. Het protocol demonstreert de effectiviteit van deze techniek en levert een verstandige casus van dit systeem.
Expressie en zuivering van zoogdieren P2X7 receptor van Sf9 insect cellen .
De P2X7-receptor is een extracellulair ATP-gated ionkanaal dat uitsluitend in eukaryoten is ontdekt (Bartlett et al., 2014). Toe te schrijven aan zijn onderscheidende eigenschappen onder P2X-receptoren, die doet denken aan de vorming van een gigantische geleidende porie, is de P2X7-receptor betrokken bij verwoestende aandoeningen zoals machtspijn (North en Jarvis, 2013) .
Desalniettemin blijven de mechanismen die ten grondslag liggen aan de specifieke eigenschappen van P2X7 slecht begrepen, deels als gevolg van de moeilijkheid van de zuivering van dit eukaryote membraaneiwit. Hier beschrijven we een diepgaand protocol voor het uitdrukken en zuiveren van een zoogdier P2X7-receptor met behulp van een insectencel-baculovirus-systeem .
De P2X7-receptor wordt tot expressie gebracht in Sf9-insectencellen als een GFP- fusie-eiwit en opgelost met een buffer die Triton X-100-detergens bevat. Het P2X7-GFP-fusie-eiwit wordt vervolgens gezuiverd in een buffer die dodecylmaltoside bevat met behulp van Strep-Tactin-affiniteitschromatografie.
Na enzymatische splitsing van de verbonden GFP en Strep-tag door trombine, wordt de P2X7-receptor op afstand verwijderd met behulp van chromatografie met uitsluiting van metingen. Deze methodologie levert soms ~ 2 mg gezuiverd eiwit op uit 6 L Sf9-traditie. Gezuiverd eiwit wordt niet minder dan 2 maanden bewaard met een buffer met 15% glycerol bij 4 ° C en gebruikt voor heel wat doelgericht en structureel onderzoek (Karasawa en Kawate, 2016).
Heterologe expressie van Paranosema (Antonospora) locustae hexokinase in lepidoptera, Sf9 , cellen wordt vastgesteld door accumulatie van het microsporidia proteïne in insectencellen cel kernen.
Paranosema (Nosema, Antonospora) locustae is het enige microsporidium dat wordt geproduceerd als zakelijk product voor biologisch beheer. Moleculaire mechanismen van de resultaten van deze ziekteverwekker en verschillende microsporidia van ongewervelde dieren op gastheercellen blijven niet gekarakteriseerd. Vooraf hebben we P. locustae-hexokinase immunogelokaliseerd in kernen van met Locusta migratoria besmette adipocyten.
Hier werd het microsporidische eiwit tot expressie gebracht in de gist Pichia pastoris en in lepidoptera Sf9-cellen. Tijdens heterologe expressie werd hexokinase van P. locustae verzameld in de kernen van insectencellen, maar niet in gistcelkernen. Dit bevestigt de nucleaire lokalisatie van hexokinase uitgescheiden door microsporidia in besmette gastheercellen en suggereert een handige mannequin voor aanvullend onderzoek.
Een kennisgedreven mannequin van een modaal gated ionkanaal: de inositol 1,4,5-trisfosfaatreceptor in insecten Sf9- cellen .
Het inositol 1,4,5-trisfosfaat (IP(3)) receptor (IP(3)R) kanaal is essentieel voor de technologie en modulatie van intracellulaire Ca(2+) waarschuwingen in dierlijke cellen. Om perceptie van de moeilijke ligandregulatie van dit alomtegenwoordige kanaal te realiseren, hebben we een eenvoudige kwantitatieve continue Markov-keten-mannequin uit de informatie geconstrueerd.
Onze mannequin is verantwoordelijk voor veel experimenteel opgemerkt poortgedrag van enkele native IP (3) R-kanalen van insecten Sf9-cellen. Ligand (Ca (2+) en IP (3)) afhankelijkheden van kanaaloefening hebben zes belangrijkste ligand-gebonden kanaalcomplexen vastgesteld, de plaats waar een fantasie bestaat uit een aantal toestanden met de identieke ligandstoichiometrie en open of gesloten conformatie.
Kanaalpoorten in drie verschillende modi voegde een gecompliceerde toe en gaf aan dat drie complexen in een aantal modi poorten. Dit beperkte bovendien de connectiviteit tussen kanaalcomplexen.
Ten slotte schetsten latenties van kanaalreacties op abrupte modificaties van ligandfocus een mannequin met een specifieke gemeenschaptopologie tussen 9 gesloten en drie open toestanden. De mannequin met 28 parameters kan nauwkeurig de evenwichtspoortstatistieken reproduceren voor alle drie de poortmodi over een breed scala aan ligandconcentraties.
Het legt bovendien de belangrijkste opties van latentiedistributies voor kanaalrespons vast. De mannequin kan falsifieerbare voorspellingen van IP (3) R-kanaalgating-gedrag genereren en inzichten verschaffen voor elke toekomstige verbetering van informatie-experimenten en de evaluatie van IP (3) R-kanaalgating verbeteren.
De meeste waarschijnlijkheidsschattingen van de etalagepop-parameters en van de parameters binnen de De Younger-Keizer-etalagepop leveren robuust statistisch bewijs op in het voordeel van onze etalagepop. Onze methodologie is eenvoudig en eenvoudig relevant voor de dynamiek van verschillende ionkanalen en moleculen.
Radioactiviteit Sf9 insectencellen cellen tonen resistentie tegen redelijke cumeenhydroperoxide.
Lepidoptera-insectencellen functioneren als een geweldige mannequin om stressreacties te beoordelen en het is bekend dat ze resistentie vertonen tegen DNA-beschadigende makelaars samen met ioniserende straling; niettemin worden beperkte gegevens aangeboden over de resultaten van membraanbeschadigende makelaars in deze cellen.
In dit onderzoek hebben we de respons van Sf9-cellen (afkomstig van de eierstokken van Spodoptera frugiperda; orde Lepidoptera) op cumeenhydroperoxide (CHPx) vergeleken met menselijke BMG-1-cellen. CHPx-remedie in doses die dodelijk zijn voor menselijke cellen veroorzaakte bovendien typische necrose in Sf9. Extreme necrose in menselijke BMG-1-cellen werd opgemerkt bij 125 M, terwijl gerelateerde impact in Sf9-cellen werd opgemerkt bij 250 M.
In Sf9-cellen induceerde CHPx (250 M) verwaarloosbare wijzigingen in het mitochondriale membraanpotentieel en intracellulaire reactieve zuurstofsoorten, terwijl een redelijke impact werd opgemerkt op de intracellulaire calciumdistributie. Verminderde DNA-schade en oxidatie van lipiden (samen met cardiolipine) werd opgemerkt in Sf9-cellen, wat heel goed het gevolg kan zijn van een redelijke staat van antioxidanten en constitutieve/geïnduceerde glutathion-S-transferase-oefening.
Dit onderzoek toont belangrijk aan dat Lepidoptera-insectencellen die een diepgaande resistentie hebben in de richting van DNA-beschadigende makelaars, alleen een redelijk grotere weerstand bieden tegen membraan-beschadigende makelaars. Een sterker afnemende setting met een milieuvriendelijk antioxidantsysteem lijkt aanzienlijk bij te dragen aan deze reactie.
